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激活素A刺激肾小管上皮细胞转分化的研究

[收录:2011-05-16] [作者:李华彬] [服务:论文代写代发] [字体: ]
内容摘要: 【摘要】   目的 研究激活素A对体外培养的人肾小管上皮细胞转分化的影响。方法 取人肾小管上皮细胞株进行体外培养,分别向培养液中加入激活素A或激活素A+卵泡抑素,应用免疫组化法检测培养细胞转化生长因子β蛋白(TGF-β)的表达,以观察肾小管上皮细胞转分化的情况。结果 与对照组和卵泡抑素组相比,激活素组肾小管上皮细胞表达的TGF-β蛋白显著增多。结论 激活素A能促进肾小管上皮细胞增殖、转分化,提示激活素A可能在肾小管间质纤维化中起重要作用。

【摘要】   目的 研究激活素A对体外培养的人肾小管上皮细胞转分化的影响。方法 取人肾小管上皮细胞株进行体外培养,分别向培养液中加入激活素A或激活素A+卵泡抑素,应用免疫组化法检测培养细胞转化生长因子β蛋白(TGF-β)的表达,以观察肾小管上皮细胞转分化的情况。结果 与对照组和卵泡抑素组相比,激活素组肾小管上皮细胞表达的TGF-β蛋白显著增多。结论 激活素A能促进肾小管上皮细胞增殖、转分化,提示激活素A可能在肾小管间质纤维化中起重要作用。 本文由教育大论文下载中心WwW.JiaoYuDa.CoM整理

【关键词】   激活素A; 卵泡抑素;肾小管上皮细胞;转化生长因子β蛋白

  Abstract Objective To study the stimulating effect of activin A on the transdifferentiation of renal tubule epithelial cells cultured in vitro.Methods Renal tubule epithelial cell strains were cultured in vitro; activin A or activin A plus follistatin were added into the culture solution and immunohisochemical method was applied in detecting the expression of transforming growth factorβ(TGF-β) protein in the cultured cells and the transdifferentiation of renal tubule epithelial cells was observed. Result The TGF-βprotein expressed by renal tubule epithelial cells in activin A group increased much more than that in control group or in follistatin group.Conclusions Activin A can promote the proliferation and transdifferentiation of renal tubule cells, which suggests that activin A may play an important role in interstitial fibrosis of renal tubule.

  KEYWORDS activin A follistatin renal tubule epithelial cells TGF-βprotein

  激活素A(activin,ACT)是由性腺分泌的肽类激素,是近年来发现的重要细胞因子,具有广泛的生物学活性[1]。ACT分泌病理性地增高或降低,可以导致组织细胞分化、增生、代谢异常[2-3]。卵泡抑素(follistatin,FS) 也是由性腺分泌的糖蛋白激素,可阻断ACT 的生物学效应。ACT和FS形成体内一对天然的拮抗体,共同调节组织细胞的分化,同样,其在肾脏细胞的分化中也具有显著调控作用。故本实验观察ACT对人肾小管上皮细胞增殖、转分化的影响,探讨ACT在肾小管纤维化中的作用,为阐明肾组织纤维化的发病机制,探讨防治方法提供新的实验依据。

   1 材料与方法

  1.1 材料

  1.1.1 细胞 人近端肾小管上皮细胞株(HK2,购自 中国 科学 院上海生物化学与细胞生物学研究所)。

  1.1.2 主要试剂 DMEM/F12培养基(DF,Hyclone公司),重组人激活素A(ACT-A)、卵泡抑素(FS),(美国Peprotech公司),胎牛血清(FCS,Gibco公司),胰蛋白酶(Gibco公司),小鼠抗转化生长因子β蛋白单抗工作液(TGF-β)、SP免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中杉生物技术公司)。

  1.2 方法

  1.2.1 细胞培养及传代 取HK2细胞株,加入含15%FCS的DF培养基,吹打后以105/ml的细胞含量接种于细胞培养瓶中,37℃、5%CO2条件下培养,3天后换液。倒置显微镜观察,待细胞融合生长为单层后,0.25%胰蛋白酶与0.02%EDTA1:1混合后消化、1:2传代,传至3~5代取细胞行各指标检测。

  1.2.2 细胞增殖检测 消化指数生长期HK2细胞,调细胞密度为1×104/ml,接种于96孔平底培养板上,37℃、5% CO2条件下培养48h,无血清FD培养液洗涤2次,加入不含血清、但含不同浓度(0.3~100ng/ml) 的ACT培养液(A组) ,换入不含血清、但含不同浓度(0.3~100ng/ml) 的FS培养液(F组),30ng/mlACT+不同浓度(0.3~100 ng/ml)FS培养液(A+F组),含无血清培养基的空白对照组(C组)再培养48h。空白对照组和每一浓度组都重复4 孔。分别于培养结束前4h加入MTT(5mg/ml)20μl/,第48h结束培养。弃上清,加入DMSO150μl /孔,振荡10min。在酶标光度计上测光吸收值,测定波长为490nm,所得光吸收值代表相应孔细胞的相对数量。

  1.2.3 免疫组化检测TGF-β 将指数生长期细胞消化后以1×104/ml /孔接种到24 孔培养板中,37℃、5% CO2条件下培养24h,无血清FD培养液洗涤2次,换入不含血清、但含不同浓度(0.3~100ng/ml) 的ACT培养液(A组) ,换入不含血清、但含不同浓度(0.3~100ng/ml) 的FS培养液(F组) ,30ng/mlACT+不同浓度(0.3~100 ng/ml)FS培养液(A+F组),含无血清培养基的空白对照组(C组),再培养48h。空白对照组和每一浓度组都重复4孔。取片,冲洗,固定,冲洗,双氧水和羊血清封闭,TGF-β单抗,PBS代替一抗作为阴性对照,4℃过夜,冲洗3次,再加入二抗,37℃水浴1小时,进行DAB法染色,以细胞浆出现棕黄色并高出背景,胞核呈浅蓝色的为阳性染色,采用Leica-Qwin图象分析系统测定每张片上的阳性单位灰度值,灰度值越高说明目标物质表达越少。

  1.3 统计学处理 数据应用SPSS10.0统计软件进行分析,P < 0.05为有显著性差异。

   2 结 果

  2.1 ACT-A 对肾小管上皮细胞生长的影响 ACT-A对肾小管上皮细胞生长有明显的促进作用,在30ng/ml以内,呈剂量依赖性,当其浓度达100ng/ml时,促进小管上皮细胞增生的作用反而减弱(P<0.01);单独给FS对肾小管上皮细胞增生无明显影响(P>0.05);但FS能拮抗ACT对肾小管上皮细胞生长的促进作用,也呈剂量依赖性(P<0.01)见表1。表1 不同浓度ACT和FS对肾小管上皮细胞生长的影响注: *与0ng/ml比较,P<0.01; #与ACT组比较,P<0.01

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