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RNAi沉默survivin基因对胰腺癌细胞增殖、凋亡和周期的影响

[收录:2011-05-16] [作者:] [服务:论文代写代发] [字体: ]
内容摘要:                    作者:田维军 赵金伟 宋晓斌
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                     作者:田维军 赵金伟 宋晓斌 

【摘要】   目的 应用RNAi技术沉默胰腺癌细胞株中survivin基因对肿瘤细胞凋亡、细胞周期和增殖的变化。方法 靶向survivin的RNAi载体转染胰腺癌细胞,Western印迹检测基因沉默效果,MTT法和流式细胞术检测细胞增殖、凋亡及细胞周期。结果 survivin基因沉默效率可达85%;MTT检测显示,干扰组survivin沉默细胞增殖抑制与非特异性质粒对照组相比显著增高(P<0.01)。流式细胞术显示,干扰组细胞凋亡百分率显著高于非特异性质粒对照组(P<0.01);G2/M期显著高于非特异性质粒对照组(P<0.01或P<0.05),而S期则显著降低(P<0.05)。结论 survivin基因沉默可引起胰腺癌细胞周期阻滞,促进细胞凋亡,抑制细胞增殖。

【关键词】   RNAi;survivin;细胞凋亡;细胞周期;胰腺癌

胰腺癌的发生、 发展 以及侵袭、转移是多基因参与、多步骤发生的过程,其中生存素(survivin)是一类在胰腺癌的发生、发展中起非常重要作用的癌基因〔1〕,其参与细胞多种重要生物学过程,包括基因转录调控、胚胎发生、细胞分化、肿瘤形成和转移等〔1,2〕。survivin在胚胎期表达丰富,而在成熟组织中则表达极少或缺失,但在病理情况下,包括胰腺癌的很多恶性肿瘤组织中均发现有survivin的高水平表达,并且其表达量与肿瘤恶性程度及转移能力呈正相关〔1,3〕。survivin的过表达和激活不仅与预后不良密切相关,而且能影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,是胰腺癌基因 治疗 的潜在靶点之一〔4,5〕。本研究选择survivin分子作为干扰靶点,检测沉默该基因后对胰腺癌细胞凋亡和细胞周期的影响,为进一步研究survivin基因在肿瘤细胞生物学特性及免疫抑制中的作用构建技术平台。

   1  材料与方法

  1.1  主要试剂 

  人胰腺癌细胞株PC3购自 中国 科学 院上海生物研究所细胞库,以含10%胎牛血清(Hyclone公司)的DMEM(Gibco公司)培养基,37℃,5%CO2孵箱(SANYO)培养。转染试剂LipofectamineTM 2000(美国Gibco公司),ECL化学发光试剂盒(美国Pierce公司),小鼠抗人单克隆survivin抗体(Santa Cruz公司)。干扰质粒pGenesil2、非特异性siRNA(武汉市晶赛生物工程技术有限公司),pGensilsiRNAsurvivin质粒由本室构建。AnnexinV凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。

  1.2  细胞培养与细胞转染 

  转染前1 d将对数生长期的胰腺癌细胞株PC3以2×105个/孔接种于6孔培养板,细胞铺板在2 ml含血清、不含抗生素的DMEM培养基中,24 h内、细胞融合达40%~60%时进行转染,将siRNA LipofectamineTM2000复合体加到培养板中(转染方法按试剂盒说明书操作),转染体系为500 μl,siRNAs终浓度为100 nmol/L。

  1.3  Western印迹检测基因沉默效果 

  收集细胞,用PBS缓冲液漂洗3次,加入200 μl 细胞裂解液混匀、冰浴30 min。15 000 r/min离心10 min,以Lowry′s 法行总蛋白定量分析。制备12%分离胶、5%积层胶,上样,在8 V/era电压条件下行SDS聚丙烯酰胺电泳,待溴酚蓝进入分离胶时,将电压提高到15 V/era。电泳结束后,将分离出的蛋白质转至硝酸纤维素膜上(Millipore,USA),5%脱脂奶粉的TBS溶液封闭2 h,鼠抗人单克隆一抗和βactin室温孵育2 h,二抗室温孵育1.5 h,ECL 试剂盒显色,拍照,比较各组灰度变化。分为siRNA干扰组、siRNA干扰对照组(用非特异siRNA LipofectamineTM 2000复合体转染)、空载体组(以空白载体复合体转染)、未转染对照组(以等量培养基处理)作为对照,观察各组干扰效果。

  1.4  MTT法检测细胞增殖 

  将各组细胞以2 000个/孔的密度接种于96孔板,体积200 μl/孔。分别于转染后24、48、72 h进行MTT检测,酶标仪测定570 μm处OD值,连续测定3 d。每个时间点设5个复孔,根据吸光度值绘制曲线,比较各组细胞生长速度变化。分为siRNA干扰组和非特异性转染对照组。

  1.5  流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡 

  分别于转染后24、48、72 h收集细胞,冷PBS洗涤2次,-20℃预冷的70%乙醇固定48 h,1 200 r/min离心10 min弃上清,1 000 μl PBS重悬加10 mg/ml RNase 20 μl混匀,37℃水浴45 min,PBS洗Rnase,100 μl PBS重悬,100 μl  PI 4℃避光染色1 h。流式细胞仪测定荧光强度,CellQuest分析软件进行细胞周期DNA含量分析,确定细胞周期分布。细胞凋亡的检测采用Annexin V细胞凋亡检测试剂盒,实验操作按说明书进行。每组细胞重复3个样本,分为siRNA干扰组和非特异性转染对照组。

  1.6  统计学分析 

  数据均以x±s表示,采用统计软件SPSS 16.0分析。

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