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探析大豆苷元对神经母细胞瘤细胞增殖的抑制作用

[收录:2010-04-07] [作者:] [服务:论文代写代发] [字体: ]
内容摘要:摘要:目的探讨大豆苷元对神经母细胞瘤SH -SY5Y 细胞凋亡和增殖的影响。方法采用细胞生长抑制实验(MTT法)、流式细胞仪检测等方法观察SH -SY5Y 细胞的形态变化、细胞凋亡率及细胞周期变化。结果10.0 ~80.0 μg/ml 的大豆苷元明显抑制细胞的增殖,且有剂量依赖性;与对照组相比,大豆苷元处理24 h 后,各组SH-SY5Y 细胞均出现亚二倍体峰(Sub-G1 ),细胞凋亡率与大豆苷元呈剂量依赖性。结论大豆苷元可诱导神经母细胞瘤SH-SY5Y 细胞凋亡,对SH-SY5Y 细胞增殖有明显的抑制作用。
摘要:目的探讨大豆苷元对神经母细胞瘤SH -SY5Y 细胞凋亡和增殖的影响。方法采用细胞生长抑制实验(MTT法)、流式细胞仪检测等方法观察SH -SY5Y 细胞的形态变化、细胞凋亡率及细胞周期变化。结果10.0 ~80.0 μg/ml 的大豆苷元明显抑制细胞的增殖,且有剂量依赖性;与对照组相比,大豆苷元处理24 h 后,各组SH-SY5Y 细胞均出现亚二倍体峰(Sub-G1 ),细胞凋亡率与大豆苷元呈剂量依赖性。结论大豆苷元可诱导神经母细胞瘤SH-SY5Y 细胞凋亡,对SH-SY5Y 细胞增殖有明显的抑制作用。 本文由教育大论文下载中心WwW.JiaoYuDa.CoM整理

关键词:  神经母细胞瘤 大豆苷元 增殖

   
  神经母细胞瘤(neuroblastoma, NB)是儿童较常见的恶性肿瘤,发病率占儿童恶性肿瘤的第3 位,与儿童期常见的其他恶性肿瘤相比,化疗效果差,严重威胁儿童的生命安全。因此,寻找新的治疗药物成为人们十分关切的问题。近年来,多种研究发现大豆异黄酮对多种癌症具有抑制和治疗作用[1] ,但对大豆异黄酮抗癌作用的研究主要集中在乳腺癌和前列腺癌等激素依赖性肿瘤,关于其对儿童神经母细胞瘤生长作用的影响研究报道很少。因此,我们于体外观察了大豆苷元对NB 细胞株SH -SY5Y 生长的影响,以期为进一步研究其作用机制及临床应用提供实验室依据。
  1  材料与方法
  1.1  材料SH -SY5Y 细胞株为贵阳医学院分子生物学重点实验室赠送。大豆苷元(Daidzein)为陕西赛德高科生物股份有限公司馈赠,纯度为98%。RPMI -1640 为Gibco 公司生产,小牛血清为杭州四季青公司生产,二甲基哑砜(DMSO)和噻唑蓝(MTT)为Sigma 公司生产。BD FACSCalibur 流式细胞仪为美国BD 公司生产;MK3 型酶标仪和3111 型CO2 培养箱均为美国Thermo 公司生产。
  1.2   方法
  1.2.1  细胞培养与接种SH -SY5Y 细胞株培养在含5%小牛血清的RPMI -1640 培养基中,CO2 培养箱内(5%),恒温37℃。当细胞长满时,用0.25%胰蛋白酶消化,收集细胞,1 000 r/min,离心5 min,PBS 洗2 次,以1 ~2 ×104 的浓度接种于96 孔板内,每孔体积为180 ml。
  1.2.2  受试药物的处理将大豆苷元溶解在DMSO 中,配成100mg/ml 的储存液, -20℃保存。使用时用完全培养基将其稀释成10 mg/ml 的工作液,用直径为0.22 μm 的微孔滤膜过滤除菌置于4℃保存,并进一步用完全培养基分别稀释成所需的不同浓度,待细胞接种24 h 后分别加入不同浓度的受试药,每孔20 μl,使其终浓度分别为0.1,1.0 ,10.0,20.0,40.0 ,60.0 ,80.0,100.0,150.0 mg/ml。每个浓度为4 个孔,同时用含DMSO 的完全培养基和空白一起作对照。MTT 用PBS(pH 8.2)配成5.0mg/ml 的溶液,磁力搅拌器搅拌30 min,直径为0.22 μm 的微孔滤膜过滤除菌后4℃保存,2 周内有效。
  1.2.3  细胞生长抑制效应的测定采用MTT 比色法[2] 。细胞接种24 h 后加受试药,之后每隔24 h 用MTT 比色法测定光密度值,即对应的活细胞数。具体操作如下:加受试药后每隔一定时间加MTT 溶液10 μl,37℃继续培养4 h,终止培养后小心吸去孔内培养上清液,每孔加入150 μl DMSO,振荡器振荡5 ~10 min,使结晶物充分溶解。选择490 nm 波长在酶联免疫检测仪上测各孔的光吸收值,记录大豆苷元作用于SH -SY5Y 细胞的浓度效应数据和时间效应数据,用下列公式计算药物对细胞生长的抑制率,并绘制效应曲线。
   
  抑制率(%)=对照孔测定的平均OD 值-加药组测定的平均OD 值照孔测定的平均OD 值×100%
  表1  大豆苷元对SH-SY5Y细胞增殖抑制率的影响(略)
  与对照组比较,★P<0.05;n=3
  1.2.4  流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期分析各组细胞培养48 h 后,收集各组细胞悬液1 ml,浓度约为106 个/ml,1 000 r/min 离心5 min,弃掉培养液,用PBS 离心冲洗两次,以70%的冷乙醇固定,4℃保存1 ~24 h,1  000 r/min 离心5 min 后,PBS 洗涤冲洗去乙醇2 次;加入RNase A(终浓度为60 μg/ml),摇匀,37℃温育30 min;加入PI(终浓度为50μg/ml)染料1 ml,4℃暗染30min。流式细胞仪检测,每份标本测定(4 ~8) ×103 个细胞,采用MoufitLT 软件对各组样本进行DNA 含量及细胞周期分析。
  1.3  统计学方法实验均重复3 次以上。所有的测定指标均采用±s表示,用SPSS 14.0 统计软件包进行分析,凋亡实验用方差分析,细胞增殖实验用t检验。以P ﹤ 0.05 表示差异有显著性。
2  结果
  2.1  大豆苷元对SH -SY5Y 细胞的生长抑制作用细胞增殖抑制实验结果显示,与正常对照组相比,大豆苷元各浓度组处理24~72 h 的细胞抑制率与正常对照组比较均有显著性升高(P<0.05)(表1,图1)。大豆苷元处理SH -SY5Y 细胞24,48,72 h的IC50 分别是65.0,47.0,40.0 μg/ml。以上结果表明大豆苷元对SH -SY5Y 细胞的体外增殖具有较强的抑制作用,其抑制作用在一定的范围内有剂量和时间依赖性,并呈现出一定的饱和性。
  图1  大豆苷元对SH-SY5Y细胞体外增殖的抑制作用(略)
  2.2   大豆苷元对SH -SY5Y 细胞周期和凋亡的影响药物处理48 h 后,大豆苷元各浓度组均能诱导H -SY5Y 细胞凋亡,G1 峰前出现亚二倍体峰(Sub -G1 ),即凋亡细胞所特有的凋亡峰(图2)。大豆苷元诱导SH -SY5Y 细胞凋亡呈现一定的剂量依赖性,细胞凋亡率显著高于正常对照组(P <0.05)。随着大豆苷元浓度的升高,G0 /G1 和G2 /M 期的细胞明显减少,DNA 合成期(S期)细胞数均明显增多,表明大豆苷元使SH -SY5Y 细胞发生S期阻滞,抑制细胞增殖。
  图2   大豆苷元对SH-SY5Y细胞周期和凋亡的影响(略)
  3   讨论
   
  NB 治疗十分棘手,人们一直在积极寻找新的治疗药物。我国中医中药用于治疗肿瘤历史悠久,具有疗效确切、毒副作用低等优点。大豆异黄酮是重要的植物化学物质,由12 种单体组成,
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